صفحه شروعكتابكامپيوترپايان نامهطرح هالينك هاي مفيدسرگرميدرباره ما

ترجمه ، تاليف ، مقاله ، پروپوزال ، پايان نامه ، آمار ، گرافيك


ايمونوبلوتينگ

 

پيشنهاد: قبلا روش SDS-PAGE را بايد ياد بگيريد.

داونلود راهنماي آناليز وسترن بلاتينگ با نرم افزار ImageJ

مقدمــه

ايمونوبلوتينگ يا وسترن بلوتينگ روشي دو مرحله اي است که طي آن ابتدا باندهاي پروتئيني جدا شده بوسيله الکتروفورز از روي ژل SDS-PAGE به غشاي ديگري که غالبا از جنس نيتروسلولز مي باشد انتقال مي يابند و در مرحله دوم توسط آنتي بادي اختصاصي، پروتئين مورد نظر شناسايي مي شود. کلمه بلوتينگ به روش انتقال اشاره دارد و کلمه ايمونو به خاطر لزوم استفاده از واکنش بين آنتي ژن و آنتي بادي اختصاصي در مرحله شناسايي مي باشد.

براي DNA و RNA و ليپيدها نيز روش انتقال مشابهي بکار برده مي شود که به ترتيب southern blot و northern blot و eastern blot ناميده مي شود.

نيرويي که موجب انتقال مولکول پروتئين از ژل به غشاء مي شود غالبا جريان الکتريکي است اما از نيروي انتشار diffusion و از فشار مکانيکي positive pressure و از نيروي افينيتي بين آنتي ژن و آنتي بادي نيز استفاده شده است. انتقال به وسيله جريان الکتريکي را الکتروبلاتينگ نيز مي نامند.

در روش ديفوزيون ساده، غشاء و ژل را رو در رو به هم مي چسبانند پروتئين با انتشار ساده به غشاي نيتروسلولز مي رسد و به خاطر خصوصيت اين غشا به آن متصل شده و متوقف مي شود و کم کم همه پروتئين موجود در ژل به غشا منتقل مي شود اين روش زمان زيادي لازم دارد.

در استفاده از فشار مثبت، غشا و ژل در حد فاصل دو محفظه قرار مي گيرند که از بافر بلوتينگ پر مي شوند و معمولا به محفظه بالايي (واقع در پشت ژل) فشار ضعيف و مثبتي اعمال مي شود جريان بافر در اثر اين فشار از جانب ژل به طرف غشا برقرار مي شود و پروتئين را با خود به غشا مي رساند و در آنجا پروتئين به غشا متصل شده و متوقف مي شود

در استفاده از افينيتي (FAT= filter affinity transfer) معمولاً آنتي بادي اختصاصي روي غشا وصل مي شود (براي جلوگيري از انتشار آن) و ژل در تماس با غشا قرار مي گيرد به مرور آنتي ژن موجود در ژل در اثر افينيتي آنتي بادي به غشا منتقل مي شود.

علاوه بر وسترن بلاتينگ، يک روش سريع ديگري نيز براي پي بردن به وجود يک پروتئين در نمونه وجود دارد که Dot blotting گفته مي شود اما در آن عملا روش انتقال بصورت نمونه گذاري دستي صورت مي گيرد يعني نمونه (معمولا محلول) را به صورت لکه دايره اي شکل كوچكي روي غشا مي گذارند و سريعا خشک مي كنند و در صورت لزوم با فيكساتور مناسب تثبيت ميكنند. از پروتئين هاي خاص براي مسدود كردن نقاط اتصال باقيمانده استفاده ميكنند. سپس طي مرحله شناسايي پروتئين مورد نظر شناسايي مي شود.

مرحله اول: انتقال پروتئين از ژل به غشاء نيتروسلولز:

طي روند الكتروبلاتينگ (انتقال بوسيله جريان برق) پروتئين هاي جدا شده در ژل پلي آكريلاميد به کمک نيروي الکتريکي به غشاي ديگري از جنس نيتروسلولز و يا PVDF و ... منتقل مي شوند. براي اين كار از دستگاه الكتروبلاتينگ استفاده مي شود

دستگاه الکتروبلاتينگ :

اين دستگاه محفظه اي شيشه اي به شکل زير است که جايگاه ويژه اي براي فروبردن يک کاست مخصوص در آن قرار دارد (در سطح داخلي ديواره شيشه اي در دو طرف مقابل هم، دو زايده از جنس شيشه، ناودان خاصي را ايجاد مي كنند كه كاست در درون آن قرار گرفته و ثابت مي شود)  در دو طرف اين جايگاه دو الکترود تعبيه شده اند جنس آند از پلاتين و فيش آن به رنگ قرمز است جنس کاتد از استيل و فيش آن سياه رنگ مي باشد جنس کاست از شيشه بوده و داراي سوراخ هاي درشت در قسمت هاي جانبي است تا جريان الکتريکي براحتي از آن عبور کند. كاست به كمك اسفنج ها، محفظه تنگ و فشرده اي را بوجود مي آورد كه از دو طرف فشار آورده و سطح رو در روي ژل با غشا را به هم نزديكتر مي كند. كاست منطقه لولا مانندي دارد كه بواسطه آن به طرفين باز مي شود. در سطح داخلي آن ابتدا دو لايه ضخيم اسفنج در طرفين قرار داده مي شود بين اين دو اسفنج از طرف کاتد (دقت شود) به ترتيب کاغذ صافي (سه برگ) و ژل و غشاي نيتروسلولزي و کاغذ صافي (سه برگ) قرار داده مي شود. غشا و کاغذ صافي ها قبلا با بافر بلوتينگ کاملا خيس مي شوند (حدود 15 دقيقه). وقتي غشاي نيتروسلولز و ژل و اسفنج و كاغذ صافي ها به طور صحيح !! در محل خود قرار داده شدند و كاست در جهتي صحيح !! در ناودان خاص خود در داخل دستگاه فرو برده شد نوبت به اتصال سيم هاي رابط مي رسد. دو الکترود دستگاه به دو جا فيش قرمز و سياه متصل هستند كه در بالاي دستگاه در معرض ديد قرار دارد. دو فيش موجود در دو انتهاي سيم رابط قرمز رنگ به جا فيش هاي قرمز رنگ موجود در دستگاه بلاتينگ و منبع تغذيه وصل مي شوند. دو فيش مشكي در دو انتهاي سيم رابط مشكي نيز به دو جافيش مشكي رنگ موجود در دستگاه بلاتينگ و منبع تغذيه وصل مي شود. وقتي از صحيح بودن جهت قرار گيري ژل به غشا (ژل به طرف كاتد و غشا به طرف آند) و صحيح بودن اتصال سيم هاي رابط مطمئن شديد وقت آن رسيده است كه منبع تغذيه روشن شود.

روش کار با منبع تغذيه: منبع تغذيه طوري ساخته مي شود که مي تواند يکي از فاکتورها (ولت يا آمپر) را ثابت نگه دارد. قبل از وصل كردن منبع تغذيه به برق شهري و قبل از روشن كردن كليد آن (اگر كليدهاي تنظيم كننده ولت و آمپر از آزمايش قبلي در آخرين درجه باز مانده باشند امكان سوختن فيوز دستگاه به دليل عبور جريان زياد وجود دارد) هر دو کليد ولتاژ و شدت جريان را کاملا مي بنديم سپس دستگاه را به برق 220 ولت شهري وصل کرده و کليد دستگاه را از حالت off به حالت on در مي آوريم. سپس اگر مي خواهيم شدت جريان (آمپر) توسط دستگاه ثابت نگه داشته شود ابتدا كليد مربوط به ولتاژ را تا آخرين حد باز مي کنيم و در مرحله بعد کليد مربوط به شدت جريان را به آرامي باز مي کنيم تا شدت جريان مورد نياز تامين شود (به صفحه نمايش بالاي اين کليد که تغييرات شدت جريان را نشان مي دهد توجه کنيد و شدت جريان را آرام آرام بالا ببريد). اما اگر بخواهيم ولتاژ ثابت بماند بصورت معكوس عمل مي كنيم يعني اول كليد آمپر را تا آخر باز مي كنيم سپس كليد ولتاژ را به اندازه مورد نياز باز مي كنيم.

نكته: براي بالا بردن عمر دستگاه، پس از اتمام كار، حتما هر دو كليد را در پايين ترين مقدار خود قرار دهيد و سپس آن را خاموش كنيد.

نکته: پس از شروع الکتروبلاتينگ، بافر در اثر عبور جريان الکتريکي گرم مي شود در اثر آن مقاومت الکتريکي کاهش يافته و باعث افزايش شدت جريان و ولتاژ مي شود ولي دستگاه يکي از آنها را با تغيير دادن ديگري اصلاح کرده و ثابت نگه مي دارد.

پس از مدت زمان معين (بسته به نوع آزمايش) وقتي كار الكتروبلاتينگ نمام شد دستگاه خاموش شده و كاست خارج مي شود سپس با احتياط كامل غشا از بقيه جدا مي شود و در يک ظرف تميز و هم اندازه و به پشت !! قرار مي گيرد تا مراحل بعدي انجام گيرد (براي جلوگيري از اشتباهات بعدي روي غشاء در يك گوشه با مداد نرم علامت گذاري مي شود).

انتخاب ظرف: ظرف بكار برده شده در اين مرحله نبايد از ابعاد غشاء خيلي بزرگتر باشد چون باعث مصرف زياد معرف ها مي گردد. ظرف بايد كاملا تميز و عاري از هر گونه پروتئين باشد چون غشا در اين مرحله ميتواند به آساني پروتئين هاي موجود در محيط را به خود جذب كند. همچنين كف ظرف بايد كاملا صاف باشد در غير اين صورت حركت مداوم غشاء در داخل آن (به منظور مخلوط كردن) موجب آسيب به غشا مي گردد.

شستشوي اوليه: براي حذف SDS و ذرات ريز ژل، غشاء چندين بار با بافر شستشو شسته مي شود. موقع شستشو از ريختن مستقيم محلول روي غشا جدا پرهيز كنيد (محلول شستشو و معرف ها را به آرامي و بر روي كف يا ديواره ظرف بريزيد) چون باندهاي پروتئني موجود در روي غشا سست هستند و در اثر كوچكترين فشار مكانيكي دچار پراكندگي شده و حتي ممكن است كنده شده و موقع شستشو از دسترس خارج شوند.

 مرحله بلوكينگ: براي پر كردن محل هاي اتصال خالي مانده (نواحي كه پروتئين براي اتصال موجود نبوده) از محلول هاي پروتئيني مخصوصي استفاده مي شود. اين كار مانع اتصال ناخواسته آنتي بادي ها به غشاء در مرحله بعدي مي شود. محلول بلوکان به ظرف حاوي غشاء اضافه شده و چند ساعت (حداقل يك ساعت و با مخلوط كردن آرام) در دماي اتاق و يا تا فردا صبح در 4 درجه (يخچال و بدون مخلوط كردن) نگهداري مي شود. از نگهداري بيش از حد غشاء در اين وضعيت پرهيز كنيد چون با اين كار در مرحله شناسايي با رنگ زمينه بالايي روبرو خواهيد شد.

نماي سطح مقطع از دستگاه الكتروبلات حاوي كاست
الكترودها در اين تصوير در نزديكي كاست رسم شده اند اما در واقع از آن فاصله دارند و درست در سطح داخلي دستگاه واقع شده اند همچنين پمپ و مسير جريان بافر در داخل آن در بعضي دستگاه ها وجود ندارد.

انتخاب غشاء:
غشاها از نظر بار الكتريكي عوامل موجود در سطح آنها به سه دسته هستند.

1 - غشاي با شارژ مثبت داراي گروه آمونيوم مي باشد و براي پروتئين هاي با بار منفي و اسيدهاي نوکلئيک مناسب است.
2 - غشاي با شارژ خنثي داراي بارهاي مثبت (گروه آمين) و منفي (گروه کربوکسيل) مساوي مي باشد.
3 - غشاي بدون شارژ و هيدروفوب که باز هم براي پروتئين ها به کار مي رود.
تقسيم بندي بعدي غشاها بر اساس اندازه سوراخ هاي موجود در آنها است. سوراخ هاي غشاها: از 0.2 تا 1.2 ميکرومتر فرق ميکند 0.2 براي بلوت کردن پروتئين يا DNA يا RNA به کار ميرود و 1.2 ميکرومتر براي موارد خاص مثل plaque and colony lifts به کار ميرود براي بلوت کردن مولکول هاي کوچکتر (20000 >) از غشاهاي با منفذ 1 ميكرومتر به خوبي استفاده شده است با افزايش اندازه منفذ احتمال عبور مولکول هاي کوچکتر از عرض غشا بالا ميرود.
غشاهاي جديدي ارائه شده اند که افينيتي بسيار بيشتر و نقاط اتصال متراكمتري نسبت به پروتئين ها دارند ولي همين افينيتي بالا موجب ايجاد رنگ زمينه (background) بسيار بالا در هنگام کار با آنها مشاهده ميشود که محبوبيت آنها را کم کرده است.

رنگ روشن کننده محل باندها در روي نيتروسلولز پانسواس ميباشد و ميتوان پس از اطمينان از محل باندها آن را با آب مقطر چندين بار شسته و مراحل بلوتينگ را ادامه داد.
نيتروسلولز نبايـد با کوماسي بلو رنگ شود در اين مورد از رنگ آميدوبلاک استفاده ميشود (Amido black) رنگ هاي بسيار حساستر از آميدوبلاک در بازار ارائه شده اند مثل Aurodye .


مزاياي بلوتينگ: پروتئين موجود در ژل در عمق وسطح است ومولکولهاي عمقي از دسترس سريع معرف ها دور هستند اما در غشاء در سطح قرار ميگيرند و بيشتر در دسترس هستند در ژل SDS مخصوصا با ژل گراديانت منافذ خيلي کوچک هستند و مولکول هاي معرف به آساني به مولکول هاي پروتئين دسترسي ندارند لذا زمان رنگ آميزي و رنگبري خيلي طولاني ميشود پروتئين ها بايد روي ژل SDS فيکس شوند (فيکساتورها ساختمان مولکول پروتئين را تغيير ميدهند) در حاليکه در روي غشا نيازي به فيکس کردن نيست چون غشا به مولکول پروتئين گرايش زيادي دارد و مانع از پخش خودبخودي آن ميشود با اينحال در بهترين شرايط فقط 90 درصد پروتئين موجود در باند روي SDS به غشا منتقل ميشود و در مراحل شستشو نيز مقاديري از پروتئين که افينيتي پاييني به غشا دارد در اثر استفاده از دترژانت ها کنده شده و خارج ميشود.
غشا مقاوم است وبه راحتي حمل ميشود نگهداري دراز مدت آن نيز ميسر است.
نکته : گوشه ژل SDS را براي پي بردن به راست و چپ ژل اندکي ميکنيم.

زمان ترانسفر:
ترانسفر از روي ژل ايزوالکتريک فوکوس مشکل است چون در ژل ايزوالکتريک فوکوسينگ پروتئين ها در محل توقف خود داراي بار الکتريکي خنثي هستند لذا بايد مدت زمان بيشتري ترانسفر ادامه يابد تا منجر به انتقال پروتئين ها شود.
زمان براي ترانسفر به غلظت ژل آکريلاميد و ضخامت ژل و سيستم بافري و انداره و شکل پروتئين دارد اگر زمان زيادتر و يا مولکول کوچکتر باشد ممکن است پروتئين از غشاي نيتروسلولز نيز رد شود غير قابل دسترس گردد و نيز زمان ناکافي موجب ماندن بخشي از پروتئين در روي ژل خواهد شد.

دماي ترانسفر:
دماي بافر در لحظه شروع الکتروبلات بايد 8 درجه باشد و بايد بين 8 تا 15 درجه حفظ شود اگر مقدار بافر کم باشد اين مسئله اهميت بيشتري پيدا ميکند دستگاه هايي ارائه شده که مرتبا بافر را در مجراي بسته اي از داخل يخ عبور ميدهند تا گرماي حاصل از عبور جريان خنثي شود.
اثر شدت جريان:
دماي زياد بافر ناشي از شدت جريان زياد موجب ميشود بلات ها blurred و يا distored شود جريان هاي ضعيف نيز بلات هاي خوبي نميدهد.

بلوک کردن ( BSA , Non fat Milk و ... )
ضرورت استفاده از محلول بلوک کننده در واکنشهاي رنگ آميزي با ايمونوگلوبولين :
آنتي بادي يک مولکول باردار است و به محل هاي با بار مخالف ميتواند متصل شود آنتي بادي با آنتي ژن هاي ديگر ميتواند به صورت کراس راکت متصل شود مخصوصا اگر آنتي بادي پلي کلونال باشد احتمال اين نوع اتصال بالا ميرود.
وجود آنزيم هاي مشابه با آنزيم به کار برده شده در سيستم رنگ آميزي در بين پروتئين هاي الکتروفورز شده مثلا آنزيم پراکسيداز يا الکالن فسفاتاز موجود در نمونه که موجب مثبت شدن رنگ آميزي به طور کاذب ميشود البته اين مشکل در رنگ آميزي بافت ها با ايمونوگلوبولين بيشتر مطرح است و محلول هاي خنثي کننده خاصي براي مقابله با آن ابداع شده است و فقط جهت اطلاع در اينجا بيان ميشود.
محلول بلوکان رقت هاي بالاي gelatin, BSA, ovalbumin ميباشد.

 سپس پروتئين مورد نظر از بين پروتئين هاي ديگر توسط آنتي بادي اختصاصي (مثلا موجود در سرم يک انسان) شناسايي شده و به آن وصل مي شود در مرحله بعد آنتي بادي دومي که در حيوان ديگري برعليه ايمونوگلوبولين انساني توليد شده و با ماده نشاندار كننده اي کونژوگه شده به سطح غشا اضافه مي شود ماده نشاندار معمولاً يك آنزيم (الکالن فسفاتاز يا پراکسيداز) مي باشد سپس سوبستراي اختصاصي آنزيم اضافه مي شود در صورت وجود پروتئين مورد نظر در نمونه مورد آزمايش آنتي بادي موجود در سرم فرد به آن وصل شده و آنتي بادي دوم (کونژوگه با آنزيم) نيز به آنتي بادي اول وصل مي شود پس از شستشو و حذف آنزيم هاي متصل نشده سوبسترا به غشا اضافه مي شود سوبسترا در اثر آنزيم متصل شده به پروتئين، تغيير يافته و محصول رنگي توليد مي کند محصول سوبسترا بايد غير محلول بوده و در سطح غشا رسوب کند تا در اثر شستشو حذف نشود. براي بالا بردن حساسيت رديابي پروتئين گاها از سوبستراهايي استفاده مي شود كه خاصيت کمي لومينسسانس دارند براي ثبت و ظهور آنها از فيلم هاي حساس راديولوژي استفاده مي شود و سپس توسط دانسيتومتر شدت نور قرائت مي گردد
مرحله رنگ آميزي:
منوکلونال Antibody
نشاندار کردن آنتي بادي اول با راديو اکتيو يا آنزيم ممکن است اما براي هر تستي و هر آنتي بادي بايد آنتي بادي را خالص کرد و نشاندار نمود که مشکل است لذا در عمل آنتي گلوبولين نشاندار به کار برده ميشود اين آنتي گلوبولين ميتواند منوکلونال و يا پلي کلونال باشد.
براي پايين آوردن background از آنتي بادي منوکلونال به جاي Ab پلي کلونال استفاده ميشود و رقيق کردن محلول آنتي بادي مصرفي نيز راه ديگري براي اين منظور است.
مقدار و غلظت آنتي بادي براي بلات به منشا آنتي بادي و اويديتي آن و غلظت Ag بستگي دارد
براي سنجش واکنش Ab هاي مختلف با نمونه پروتئيني واحد ميتوان نمونه را در همه Trackها ريخت الکتروفورز کرد و بعد از ترانسفر ، غشا را به صورت نواري بريد و با آنتي باديهاي مختلف مجاور نمود.
نکته : پراکسيداز با آزايد غير فعال ميشود لذا بافر شستشو و محلول آنتي بادي دوم نبايد آزايد داشته باشد.

Anti-IgG کونژوگه با HRP يا AP
ميتوان با برخي مواد تا اندازه اي آنزيم هاي مداخله کننده را غير فعال کرد آنزيم پراکسيداز در موقع فريز کردن و فيکس کردن نيز خاصيت خود را حفظ ميکند
براي تشخيص آنزيم هاي مداخله کننده در واکنش روشنگر ميتوان سوبسترا را با حذف مرحله آنتي بادي کونژوگه با آنزيم به کار برد در اين صورت مثبت شدن رنگ آميزي به آنزيم موجود در نمونه برميگردد و کاذب است.
محصول سوبسترا بايد رنگي و نامحلول باشد.

سيستم هاي کونژوگه:
در موقع به کار بردن سيستم کونژوگه بيوتين-آويـــديــن يا بـيـــوتين-استرپتاويدين بايد توجه نمود که خود نمونه داراي بيوتين نباشد يعني بايد از آن اطمينان پيدا کرد
اتصال بين بيوتين و استزپتاويدين 10 برابر محکمتر از اتصال Ag با Ab اختصاصي است
مزيت هاي استرپتاويدين : اولا داراي کربوهيدرات در مولکول خود نيست و لذا به مولکول هاي لکتيني موجود در نمونه نمي چسبد
نقطه ايزوالکتريک آن نزديک به خنثي است و در Ph فيزيولوژيک اتصال غير اختصاصي کمتري دارد ولي Ph ايزوالکتريک آويدين 10 است و در Ph فيزيولوژيک داراي بار مثبت است و لذا احتمال اتصال غير اختصاصي در آن بالاتر است.
کونژوگه استرپتاويدين با آنزيم پايداري بيشتري دارد و ميتوان محلول رقيق شده و آماده مصرف آن را تا مدت هاي مديد نگهداري کرد
لکتين ها ميتوانند به جاي آنتي بادي به کار روند در اين صورت يا خود لکتين نشاندار است ويا ليگاند آن را نشاندار ميکنيم.

در ECL سوبسترايي که با Ab دوم حاوي پراکسيداز واکنش ميدهد داراي ماده لومينسسانس است که نور از خود ساطع ميکند و اين نور با فيلم هاي حساس به نور ثبت و بعد قرائت ميشود معايب: در مقايسه با راديواکتيو زمان ساطع شدن نور محدود است و نميتوان مثل قبلي براي واکنش Ab هاي مختلف بر عليه يک پروتئين واحد بکار برد و حساسيت ECL مساوي يا بيشتر از راديوليبل است.
براي كمي‌سازي نتايج وسترن بلات يا ژل مي‌توانيد از نرم افزار هاي مختلفي مثل فتوشاپ يا ImageJ استفاده كنيد. راهنماي كار با ImageJ را در اين آدرس خواهيد يافت.

  دفتر ترجمه ، تاليف و نشر استيار

s_rasoul@yahoo.com
 

 

پست الكترونيك ما :

s_rasoul@yahoo.com

 

پست الكترونيك ما :

soleymanirasool@gmail.com

شماره تماس :

09362976920

سايت اينترنتي :

http://www.soleimani.us