صفحه شروعكتابكامپيوترپايان نامهطرح هالينك هاي مفيدسرگرميدرباره ما

ترجمه ، تاليف ، مقاله ، پروپوزال ، پايان نامه ، آمار ، گرافيك

الکتروفورز روي ژل SDS-PAGE :

داونلود راهنماي آناليز ژل با وسترن با نرم‌افزار ImageJ

توجه : منومرهاي اکريلاميد و بيس آکريلاميد شديداً سمي هستند و از تماس پوست و مخاط تنفسي با آنها چه به صورت محلول و چه به صورت خشک پرهيز کنيد در ژل ساخته شده نيز مقادير اندکي منومر وجود دارد لذا براي حمل و برداشتن ژل از دستکش مناسب استفاده کنيد.
انتخاب سيستم بافري:
براي درست کردن ژل دو انتخاب وجود دارد
1 – continuous system
2 - discontinuous system
اگر در کل پروسه از يک غلطت و يک نوع بافر و pH استفاده بکنيم روش الکتروفورز continuous ميباشد.
اگر قسمت هاي مختلف پروسه (از نظر غلظت و بافر و pH ) متفاوت باشد روش الکتروفورز ما discontinuous ميباشد.
مثلا براي DNA يک نوع ژل (معمولا با غلظت کم) درست ميکنيم(continuous) اما براي پروتئين (معمولا) دو نوع يکي رقيق (با منافذ درشت) و با pH کمتر از 7 درست ميکنيم که در بالا قرار ميگيرد و نمونه به داخل آن لود ميشود (stacking gel) دومي غليظ و با منافذ کوچکتر و با pH قليائي که در زير قرار دارد و باعث جداسازي پلي پپتيدها ميشود (resolving gel ) از نظر pH بافر نيز ممکن است مخزن بافر بالايي با مخزن بافر پاييني متفاوت باشد

ساختمان ژل :
ژل SDS-PAGE از پليمرهاي آکريلاميد ساخته ميشود که بيس آکريلاميد به صورت نوارهاي عرضي اين پليمر را به طور منظم به هم ارتباط ميدهد طوري که منافذ با قطر معين و يکسان در ژل ايجاد ميشود پليمريزاسيون ژل با اضافه کردن آمونيوم پرسلفات (يا ريبوفلاوين) شروع ميشود و با افزودن TEMED (يا DMAPN ) تسريع ميشود.
TEMED = N,N,N',N' –tetramethyethylenediamine
DMAPN = 3-dimethylamino-propionitrile
TEMED موجب تشکيل راديکال هاي آزاد از پرسلفات آمونيوم ميشود و اين راديکال ها پليمريزاسيون را باعث ميشوند چون باز آزاد موجود در TEMED براي اين پروسه ضروري است لذا در pH پايين پليمريزاسيون بطئـي است و يا کاملا متوقف ميشود (لذا در مواقعي که سيستم بافري خيلي اسيدي است بايد از کاتاليت هاي مناسب ديگر مثل سلفيت سديم يا اسيد اسکوربيک يا سلفات آهن استفاده شود).
افزايش TEMED (يا APS) سرعت پليمريزاسيون را افزايش ميدهد.
سيستم پليمريزاسيون ريبوفلاوين + TEMED نياز به نور دارد ريبوفلاوين در اثر نور راديکال هاي آزاد توليد ميکند و پليمريزاسيون ژل انجام ميشود.
ريبوفلاوين يا آمونيوم پرسلفات کداميک؟
موقعي که پروتئين native به پرسلفات حساس است در سيستم continuous ميتوان قبل از لود کردن پروتئين جريان را برقرار کرد تا پرسلفات از ژل خارج شود و سپس نمونه را لود نمود اما در سيستم discontinuous وضعيت بافري ژل stacking با اينکار دگرگون ميشود و بهتر است حداقل در ژل stacking به جاي پرسلفات از ريبوفلاوين به عنوان کاتاليزور استفاده کرد.
وجود اکسيژن محلول در ژل، پليمريزاسيون را مهار ميکند لذا محلول ژل تهيه شده را قبل از اضافه کردن TEMED با استفاده از پمپ مکنده به مدت يک دقيقه degassed ميکنند.
اندازه منافذ ژل اولا با غلظت کل منومرهاي آکريلاميد در ژل ارتباط دارد ثانيا با نسبت بيس آکريلاميد به آکريلاميد مرتبط است.
غلظت کل آکريلاميد (T) : اگر غلظت آکريلاميد کمتر از 5/2 درصد باشد منافذ ژل بزرگ بوده و براي غربالگري مولکول هاي درشت با وزن مولکولي 1000 کيلودالتون مناسب ميباشد و با ژل آگارز 5/0 درصد برابري ميکند اگر غلظت اکريلاميد 30 درصد باشد (با فرض اينکه بيس آکريلاميد کافي براي ايجاد پيوندهاي عرضي موجود باشد) منافذ آن کوچکترين بوده و براي غربالگري مولکول هاي با وزن 2 کيلودالتون خوب است.
نسبت بيس آکريلاميد به آکريلاميد C : از نظر تئوري هر قدر بيس آکريلاميد نسبت به آکريلاميد بيشتر شود اتصال هاي عرضي بين پليمري زياد شده و اندازه منافذ کاهش مييابد اما مطالعات نشان ميدهد تا غلظت g/100 15 براي T بهترين حالت وقتي است که مقدارC 5 درصد است وقتي C بيشتر ميشود اتصالات عرضي به نحوي ايجاد ميشوند که بين دو پليمر مجاور فضاهاي خالي ايجاد ميشود و عملا تاثير معکوس در کاهش اندازه منافذ دارد اما وقتي T بيشتر ميشود مقدار مورد نياز بيس آکريلاميد براي رسيدن به منافذ کوچکتر بيشتر ميشود.
وقتي T برابر 5 درصد و C نيز 5 درصد است اندازه منافذ 20 نانومتر است.
وقتي C به بالاتر از 30 تا 50 درصد ميرسد اندازه منافذ 500 الي 600 نانومتر است (اثر معکوس).
در اثر SDS پلي پپتيدها بار الکتريکي منفي پيدا ميکنند که نسبت اين بار به وزن مولکول براي همه پلي پپتيدهاي موجود در نمونه يکسان است و عملا ژل SDS-PAGE با تکيه بر اندازه منافذ ژل بر اساس اندازه مولکول آنها را از هم جدا ميکند و به کار بردن مارکرهاي وزن مولکولي نيز بر اين اساس توجيه ميشود به کار بردن اوره غليظ به جاي SDS ميتواند موجب دناچور شدن پروتئين شود اما بار الکتريکي را که SDS مي بخشد جبران نميکند و لذا در اين حالت پلي پپتيدها هم بر اساس بار الکتريکي ذاتي پلي پپتيد و هم بر اساس اندازه مولکول از هم تفکيک ميشوند.
فرمول آکريلاميد و بيس اکريلاميد:


 

انتخاب غلظت مناسب ژل: براي استفاده در سيستم بافري غير دناچوره کننده (بدون SDS ) بهتر است چندين غلظت از 5 تا 15 درصد را امتحان کرد و غلظت مناسب را پيدا کرد در کار با سيستم بافري دناچور کننده SDS-PAGE نيز ميشود همين کار را کرد اما اگر وزن پلي پپتيد مورد نظر معلوم باشد با استفاده از منحني هاي موجود غلظت ژل را ميتوان حدس زده و محدوده کمتري را امتحان نمود به طور کلي با توجه به تصوير زير:

 

وقتي غلظت ژل 10 درصد است پلي پپتيدهاي کوچکتر از 16000 در جلوي بافر حرکت ميکنند
وقتي غلظت ژل 5 درصد است پلي پپتيدهاي کوچکتر از 60000 در جلوي بافر حرکت ميکنند
ژل از پليمرهاي آکريلاميد ساخته ميشود که داراي منافذ معيني است و اندازه اين منافذ با توجه به نياز ما بايد تنظيم شود الکتروفورز در حقيقت عبور جريان الکتريکي از بستر ژل است که پروتئين ها را مجبور ميکند بر اساس بار الکتريکي که دارند به سوي آند حرکت کنند پروتئين ها در حالت طبيعي بار منفي دارند که به توالي اسيدهاي آمينه آنها بستگي دارد ولي در اثر SDS سرتاسر مولکول به طور يکنواخت از بارهاي منفي پوشيده ميشود و فقط وزن مولکولي پروتئين به عنوان عامل تفکيک عمل ميکند پروتئينهاي با وزن مولکولي کوچکتر سريعتر از مولکولهاي درشت حرکت ميکنند حرکت هر پروتئين خاص (در غلظت هاي مختلف ژل) از منحني لگاريتمي خاص خود تبعيت ميکند (منحني فرگوسن) لذا اگر پروتئين مورد نظر اندازه درشتي دارد بايد اندازه منافذ ژل را بزرگتر بسازيد و برعکس اگر اندازه پروتئين مورد جستجو کوچک است منافذ با سايز کوچک لازم است .
Ferguson plot: در ژل SDS-PAGE حرکت نسبي (Rf=relative mobility) يک پلي پپتيد به صورت Log10 با غلظت هاي مختلف ژل (T) يک منحني را تشکيل ميدهد که منحني فرگوسن مينامند.

انتخاب ضخامت و شکل ژل:
ضخامت ژل : چون حرارت در سطح ژل تعديل ميشود اما در عمق ژل تعديل حرارت تقريبا متوقف است اين اختلاف در دما بين سطح و عمق سبب ميشود پروتئين در عمق سريعتر از سطح حرکت کند و در عين حال با افزايش حرارت، حرکت مولکول ها بيشتر شده و پخش خودبخودي نيز رخ ميدهد لذا منجر به کاهش رزولوشن باند ها ميشود لذا ضخامت ژل نبايد خيلي بيشتر باشد.
شکل ژل: در مواقعي که محقق قصد دارد تا مولکول مورد نظر را تخليص کرده و اثر بيولوژيک آن را بررسي کند (نمي خواهد رنگ کند) يا ميخواهد پلي پپتيدهاي نشاندار شده با راديواکتيو را با کانتر مربوطه در برش هاي ژل جستجو کند يا وقتي مقدار نمونه بيشتري لازم است الکتروفورز شود از ژل هاي مدور حداکثر به قطر cm 6/0 استفاده ميشود به خاطر مزاياي زياد ژل هاي مسطح امروزه از ژل هاي مدور استفاده نميشود.

انتخاب pH بافر:
در SDS-PAGE با سيستم continuous از pH 3 تا 10 را ميتوان به کار برد و پروتئين پوشيده از SDS در هر حال داراي بار منفي است و حرکت خواهد داشت در pH هاي بالاتر يا پايين تر از اين محدوده هيدروليز پروتئين ها و دآميناسيون اتفاق مي افتد اما وقتي پروتئين در حالت native الکتروفورز ميشود انتخاب pH خيلي مهم است اولا pH بايد در محدوده اي باشد که پروتئين از نظر بيولوژيک غير فعال نشود ثانيا در pH ايزوالکتريک پروتئين حرکتي نخواهد داشت و هر قدر pH سيستم از pHI فاصله داشته باشد بار پروتئين بيشتر و حرکت آن سريعتر است
نقش stacking ژل : چون pH و بافر استفاده شده در ژل stacking اسيدي است و بافر مخزن بالايي قليائي است و چون اين ژل داراي منافذ درشتي است به محض برقراري جريان پروتئين هاي مشابه در يک رديف جمع شده و تفکيک اوليه اي در کمپلکس پروتئيني صورت ميگيرد که در نهايت منجر به رزولوشن بيشتر ميشود و به خاطر همين تفکيک اوليه اي که صورت ميگيرد مقدار پروتئين لود شده به ژل ميتواند بيشتر باشد بدون اينکه رزولوشن را تحت تاثير قرار دهد.
ميزان رزولوشن : براساس ضخامت باندهاي ايجاد شده تعريف ميشود هر قدر باند ايجاد شده باريک تر باشد رزولوشن بيشتر است.
قدرت تفکيک : فاصله بين باندهاي ايجاد شده صرف نظر از ضخامت باندها را مي گويند.
براي بالا بردن رزولوشن : نمونه نبايد بيش از حد باشد، از سيستم discontinuous استفاده شود، يونهاي موجود در نمونه قبل از لود حذف شود.
بالا بردن تفکيک : براي بالا بردن قدرت تفکيک بين 2 پلي پپتيد مشخص غلظت خاصي از ژل بهترين است ولي امکان تفکيک يکسان براي همه پلي پپتيدهاي موجود در يک نمونه داراي کمپلکس پروتئيني غير ممکن است لذا بسته به وزن مولکولي و ساختمان پروتئين مورد جستجو غلظت مناسب ژل را بايد به طور تجربي تعيين کرد.

تهيه ژل براي الکتروفورز:
نکته : حجم مورد نياز از ژل محلول را با استفاده از طول و عرض و ضخامت ژل مورد نظر محاسبه نموده و با استفاده از ژل غليظ ذخيره آماده ميکنيم (جدول صفحه بعد)
نکته : ابتدا صفحات شيشه اي و نوارهاي پلاستيکي فاصله ساز را با الکل 70 درجه تميز ميکنيم و بعد رويهم سوار ميکنيم و با گيره ثابت ميکنيم.
با ژل غليظ و زودبند يا با ژل آگارز (اگر spacer ها کمي بيرون از لبه شيشه ها باشند براحتي از بيرون با ژل آگارز ميتوان درزگيري کرد) پس از درزگيري با پي پت پاستور از ته قالب شروع کرده و ژل را ميريزيم تا 1 سانتي متر مانده به لبه شيشه کوتاه از ژل جداکننده پر ميکنيم بايد به آهستگي کار کرد تا از ايجاد حباب جلوگيري شود و بلافاصله سطح بالايي ژل را به آرامي با الکل ايزوبوتانول و يا اتانول مي پوشانيم 45 دقيقه در دماي اتاق صبر ميکنيم تا ژل کاملا پليمريزه شود اگر ژل زودتر ببندد اشکال دارد و شکننده ميشود (در اين لحظه ميتوان روي ژل را با بافر resolving پوشانده و تا فردا صبر کرد) بعد الکل را خالي کرده و با آب شستشو داده و بيرون ميزيزيم آب اضافي موجود را با ريختن مقدار کمي بافر stacking ميگيريم ژل استاکينگ (معمولا 4 درصد با pH = 6/6 ) را تا لبه شيشه کوتاه پر ميکنيم و بلافاصله شانه مخصوص درست کننده چاهک را در آن فرو ميبريم شانه معمولا با ژل پاييني 5/0 سانتي متر فاصله دارد 30 دقيقه صبر ميکنيم تا ژل بالايي نيز پليمريزه شود. (بسته به مقدار نمونه اي که لود ميشود و بسته به ابعاد چاهک ميتوان طول ژل stacking را بيشتر کرد اگر طول ژل stacking کم باشد رزولوشن پايين خواهد بود.
مجموعه ژل و قالب آماده شده را در دستگاه الکتروفورز نصب ميکنيم به طوريکه شيشه کوتاه به طرف داخل قرار گيرد و با گيره هاي مخصوص در محل ثابت ميکنيم بافر را در حوضک بالايي آنقدر پر ميکنيم که به حوض پاييني نيز سرازير شود به دقت شانه را برميداريم ژل آماده نمونه گذاري است به مقدار مناسب (35 ميکروليتر ) از نمونه قبلا آماده شده به هر چاهک منتقل ميشود از مارکرهاي وزن نيز 20 ميکروليتر و معمولا در چاهک هاي طرفين ريخته ميشود حوضک ها از بافر کاملا پر ميشود بعد به جريان برق دستگاه وصل ميشود روي 200 ولت به مدت 40 دقيقه الکتروفورز ادامه مييابد.
مشخص کردن باندها: براي تعيين محل باندهاي ايجاد شده از رنگ کوماسي استفاده ميشود
رنگ آميزي نقره در SDS-PAGE : نقره 1 تا5 نانوگرم پروتئين را نشان ميدهد.
کوماسي بلو 40 تا 50 نانوگرم پروتئين را نشان ميدهد.

راهنماي آناليز ژل با نرم افزار ImageJ

دفتر ترجمه ، تاليف و نشر استيار

Telegram ID (Click now): @soleimani42
 

 

پست الكترونيك ما :

s_rasoul@yahoo.com

 

پست الكترونيك ما :

soleymanirasool@gmail.com

شماره تماس :

09362976920

سايت اينترنتي :

http://www.soleimani.us